Cómo leer el certificado de análisis de un péptido

Para qué sirve un certificado de análisis

El certificado de análisis (COA, por sus siglas en inglés) resume las pruebas hechas a un lote concreto. Para un laboratorio o un grupo de investigadores es el primer filtro de calidad: las impurezas relacionadas con el péptido pueden influir en los estudios funcionales y llevar a conclusiones erróneas². La guía de la EMA, vigente desde el 1 de junio de 2026, enumera la especificación esperada, de la identificación y la pureza al contraión, el TFA residual, el agua, los solventes residuales, las endotoxinas bacterianas y la pureza microbiológica⁵. Esa lista es una buena plantilla para leer cualquier certificado.

Pureza por HPLC: qué significa «≥98 %»

La cifra más visible suele salir de una cromatografía líquida de fase reversa con detector ultravioleta, el método de rutina para el control de calidad de péptidos³. El cálculo es una normalización de áreas: el área del pico principal frente al área de todos los picos detectados. En un estudio de control de calidad de la Universidad de Gante, la detección se hizo a 210 y 215 nm, con un umbral de notificación del 0,1 % del área del pico principal¹; para la oxitocina y los acetatos se ha descrito la detección a 220 nm⁸. Por tanto, «≥98 %» significa que al menos el 98 % de la señal ultravioleta integrada corresponde al pico principal.

Esa definición tiene límites que conviene conocer. El agua y los contraiones se miden con pruebas aparte y no forman parte de ese porcentaje⁵⁷. Una impureza que eluye junto al pico principal queda escondida dentro de él: la EMA pide considerar el riesgo de impurezas coeluyentes y, si se observan como un solo pico, aplicar el umbral de calificación de 1,0 %⁵. Un buen certificado declara el método y adjunta el cromatograma con los picos integrados; las normas de la FDA exigen que el registro de laboratorio conserve esos datos¹⁵.

¿Qué hay en el porcentaje restante? Sobre todo impurezas propias de la síntesis en fase sólida: secuencias con un aminoácido de menos (deleciones) o de más (inserciones), diastereómeros por racemización, restos de grupos protectores, oxidaciones y dímeros². Los reguladores fijan umbrales precisos. Según la Farmacopea Europea, las impurezas relacionadas con el péptido se notifican por encima del 0,1 %, se identifican por encima del 0,5 % y se califican por encima del 1,0 %⁵. La FDA, en su guía para genéricos sintéticos de glucagón, liraglutida, nesiritida, teriparatida y teduglutida (resumida en una presentación oficial de 2022), pide identificar y justificar toda impureza nueva entre 0,10 % y 0,5 %, y establece que una impureza nueva «> 0.5% is not acceptable» (en español: «> 0,5 % no es aceptable»)⁶.

Identidad: la espectrometría de masas

La pureza indica cuánto del material es un solo componente; no dice cuál es. Para eso está la espectrometría de masas. La ionización por electrospray (ESI) produce iones con varias cargas: el espectro de una molécula grande aparece como una serie de picos en la que cada uno difiere del vecino en una carga⁴. Por eso un péptido de masa M aparece en relaciones masa/carga como (M + 2H)/2 o (M + 3H)/3, y el programa del equipo reconstruye la masa a partir de esa serie. La EMA pide tablas con los valores de masa teóricos y observados⁵. Al leer el certificado, conviene comprobar que la masa observada coincide con la teórica de la secuencia declarada, que se aclare si se trata de masa monoisotópica o promedio y que se adjunte el espectro.

La masa tiene un punto ciego: dos diastereómeros pesan exactamente lo mismo, y la racemización es una impureza conocida de la síntesis². La EMA recomienda al menos dos métodos ortogonales de identificación (por ejemplo, masa junto con tiempo de retención relativo, mapeo peptídico, análisis de aminoácidos o RMN) y advierte que el control de diastereómeros puede requerir métodos específicos⁵. En el estudio de Gante, el compuesto principal de una muestra tenía una estructura distinta de la solicitada¹, un error que la pureza por sí sola no habría revelado.

Pureza no es contenido: contraiones, sales y agua

Este es el punto que más confusión genera. Un polvo liofilizado con 99 % de pureza por HPLC no es 99 % péptido en peso: contiene además contraiones, agua y a veces solventes. El caso mejor documentado es un candidato a material de referencia certificado de angiotensina II del Consejo Nacional de Investigación de Canadá: el contraión trifluoroacetato representaba casi el 25 % de la masa y el contenido final asignado fue de 691 ± 9 mg/g⁷. Es decir, alrededor del 69 % del polvo era péptido. Ese valor es el contenido neto de péptido; la EMA indica que la valoración por cromatografía se expresa sobre la sustancia anhidra y libre de contraión⁵.

¿Por qué hay contraiones? Los péptidos se cortan de la resina y se purifican con ácido trifluoroacético, de modo que los péptidos catiónicos se obtienen como sales de trifluoroacetato; la mayoría de los péptidos aprobados se comercializan, en cambio, como acetatos⁸. La diferencia no es solo de peso. En cultivos de osteoblastos, el TFA a 10⁻⁸–10⁻⁷ M redujo el número de células, y las sales de TFA de amilina y calcitonina llegaron a ocultar un efecto proliferativo o a sugerir uno antiproliferativo inexistente; los autores recomendaron convertir los péptidos a clorhidrato antes de evaluar sus efectos biológicos⁹. El contraión puede cuantificarse por cromatografía iónica, y la liofilización con ácido clorhídrico o acético reduce el TFA¹⁰. La cuestión de las sales también importa en los GLP-1, como se explica en GLP-1 magistrales: sales, impurezas y anticuerpos.

El agua es el tercer componente. La humedad residual es un atributo crítico de calidad de los productos liofilizados, y la valoración de Karl Fischer es el método habitual para medirla, frente a alternativas no destructivas como la espectroscopia en el infrarrojo cercano¹¹; la EMA la incluye en la especificación y espera que forme parte de los estudios de estabilidad cuando el polvo es higroscópico⁵. La consecuencia práctica para el investigador es saber si los miligramos de la etiqueta son de polvo o de péptido neto: por ejemplo, 10 mg de polvo con un contenido de péptido del 70 % aportan 7 mg de péptido. Cómo conservar después ese polvo se explica en Estabilidad de los péptidos.

Endotoxinas, esterilidad y solventes residuales

La prueba de endotoxinas y la de esterilidad miden cosas distintas. Las endotoxinas se determinan con el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), que la FDA acepta desde hace más de 30 años en lugar de la prueba de pirógenos en conejos y que describe el capítulo <85> de la USP¹². El resultado debe expresarse con cifra y unidades, por ejemplo en EU/mg, junto a su límite. Un estudio húngaro sobre semaglutida vendida en línea muestra por qué ambas pruebas importan: los tres viales liofilizados comprados no tenían microorganismos viables en el momento del análisis, pero todos contenían endotoxinas, entre 2,16 y 8,95 EU/mg¹³.

Los solventes residuales se rigen por la guía ICH Q3C, que los divide en tres clases: solventes que deben evitarse (clase 1), que deben limitarse (clase 2) y de bajo potencial tóxico (clase 3)¹⁴. Para la clase 2 fija límites concretos: 410 ppm para el acetonitrilo, 600 ppm para el diclorometano y 880 ppm para la N,N-dimetilformamida; para la clase 3, hasta 0,5 % se considera aceptable sin justificación adicional¹⁴.

Lote, fechas y laboratorio

Un certificado solo vale para el lote que describe. Las normas de buenas prácticas de la FDA exigen que el registro de laboratorio identifique la muestra con su número de lote, la fecha de toma y de recepción, el método usado, todos los datos obtenidos (incluidos los gráficos y espectros de los instrumentos, identificados con el lote), los cálculos, las iniciales o la firma de quien hizo cada prueba con su fecha y la revisión firmada de una segunda persona¹⁵. La EMA espera trazabilidad del material desde la síntesis hasta el principio activo final⁵.

¿Análisis propio o de terceros? El grupo de Gante encontró que, aunque los 98 péptidos venían con un certificado de pureza ≥95 %, solo 43 la cumplían, y recomendó a los investigadores mantener un control de calidad propio¹. Para un laboratorio, la opción más sólida es combinar el certificado del proveedor con una verificación independiente, al menos de identidad por masa, en los lotes clave de cada protocolo de investigación.

Señales de alerta y límites del certificado

• Sin espectro de masas ni masa observada: la pureza sola no confirma la identidad¹⁵.
• Cromatogramas idénticos (mismos tiempos de retención, mismas áreas, misma línea base) en lotes distintos: cada lote genera sus propios datos¹⁵.
• Sin número de lote, sin fechas de análisis o sin firmas¹⁵.
• Pureza sin contenido de péptido, contraión ni agua cuando el material se pesa para preparar soluciones⁵⁷.
• Endotoxinas como «conforme» sin cifra ni unidades¹²¹³.
• Un 99,9 % sin cromatograma integrado ni método, o un laboratorio que no puede identificarse¹¹⁵.

Incluso un certificado impecable tiene límites. Es una fotografía del lote en la fecha del análisis; por eso la EMA exige estudios de estabilidad aparte⁵. Los estudios de mercado muestran, además, la distancia que puede haber entre lo declarado y lo medido: en tres viales de semaglutida rotulada al 99 %, la pureza medida fue de 7,7–14,4 %¹³, un hallazgo revisado en ¿Qué hay realmente en el vial?. Un certificado bien leído no elimina esos riesgos; permite detectarlos a tiempo.